新余 网站建设,酒店网站建设功能,某企业电子商务网站建设,小程序制作填写信息骨肉瘤细胞来源于对辐射不敏感的骨形成间充质细胞。因此#xff0c;科学家们希望找到新的方法能够使其对放射增敏。研究人员进行了使用PARP抑制剂Olaparib来增强骨肉瘤细胞的放射敏感性的研究。
研究方法主要包含以下几项实验#xff1a;通过CCK-8和克隆形成实验评估Olapari…骨肉瘤细胞来源于对辐射不敏感的骨形成间充质细胞。因此科学家们希望找到新的方法能够使其对放射增敏。研究人员进行了使用PARP抑制剂Olaparib来增强骨肉瘤细胞的放射敏感性的研究。
研究方法主要包含以下几项实验通过CCK-8和克隆形成实验评估Olaparib对骨肉瘤细胞增殖的影响。使用流式细胞术分析细胞周期和凋亡。使用免疫荧光染色观察γ-H2AX、53BP1和Rad51蛋白的核聚焦。评估Olaparib与辐射结合对骨肉瘤细胞双链DNA断裂的影响。
研究中用到的最重要的试剂 Olaparib 购自 AbMole生物 www.abmole.cn
AZD2281 (Olaparib) | 763113-22-0 | 美国AbMole | Olaparib; KU-0059436
具体的实验方法如下
细胞培养使用的细胞系包括人类骨肉瘤细胞系U2OS和鼠类骨肉瘤细胞系K7M2。 细胞在DMEM培养基中培养添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素。 细胞在37°C、5% CO2的恒温培养箱中培养。
辐射条件X射线辐射使用X-RAD225 OptiMAX辐射器进行。
外显子基因测序对U2OS和K7M2细胞系进行外显子测序分析DNA修复基因序列的突变。
PARPi处理使用Olaparib粉末M1664; AbMole, USA溶解在DMSO中然后用DMEM稀释到所需浓度。
CCK-8实验使用CCK-8试剂盒测定细胞增殖。 在96孔板中添加细胞隔夜培养后加入CCK-8孵育2小时后测量吸光度OD值。
克隆形成实验将细胞种植在六孔板和60毫米培养皿中经过X射线和碳离子辐射后培养10-14天固定和染色然后在显微镜下观察和计数克隆。 细胞迁移实验使用划痕实验来描述骨肉瘤细胞的迁移行为。 细胞凋亡实验使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测早期和晚期凋亡。
细胞周期实验使用流式细胞术分析细胞周期分布。
免疫荧光染色使用免疫荧光染色技术观察γ-H2AX、53BP1和Rad51蛋白的核聚焦。
Western blot分析提取蛋白质进行SDS-PAGE电泳转膜阻断孵育一抗和二抗使用化学发光成像系统可视化条带。
Olaparib与辐射结合显著降低了骨肉瘤细胞的增殖和克隆形成能力。Olaparib单药治疗对骨肉瘤细胞的凋亡效果有限但与辐射结合后显著增加了凋亡细胞的百分比和G2/M期阻滞。 Olaparib增强了X射线和碳离子辐射诱导的骨肉瘤细胞凋亡。免疫荧光实验显示与单独辐射组相比联合组中γ-H2AX和53BP1的聚焦形成显著增加而Rad51的聚焦数量显著减少。Western blot结果显示Olaparib与辐射结合后γ-H2AX和53BP1的蛋白表达水平显著增加而Rad51的蛋白表达水平显著降低。 这些结果表明Olaparib与X射线或碳离子结合使用可以增强骨肉瘤细胞对辐射的敏感性通过抑制细胞增殖、迁移、促进凋亡、引起G2/M期阻滞、增加复杂的DNA损伤以及抑制DNA损伤修复等机制。
鸣谢Radiosensitization of Osteosarcoma Cells Using the PARP Inhibitor Olaparib Combined with X-rays or Carbon Ions - PMC (nih.gov)
